исследования agct

Данные доклинических испытаний подтверждают потенциал технологии.

Эффективность выключения гена CCR5, а также скрининг внецелевой активности в локусе ближайшего гомолога CCR5 – гена CCR2, оценивались с использованием высокоточного метода молекулярного анализа цифровой капельной ПЦР, позволяющего надёжно фиксировать внесённые изменения в геноме. Полученные результаты показали, что оптимизированный протокол обеспечивает стабильно высокий и воспроизводимый уровень редактирования CCR5 в гемопоэтических стволовых клетках с низкой нецелевой активностью. При этом доставка нуклеазы в виде мРНК не нарушает жизнеспособность и функциональность ни Т-лимфоцитов, ни гемопоэтических стволовых клеток, а уровень нецелевой активности CCR5-Uco-TALEN является низким, что подтверждает благоприятный профиль безопасности и клиническую применимость данного подхода.

В ходе развития технологии AGCT протокол генного редактирования гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) был последовательно оптимизирован с учётом современных подходов к электропорации, работы с мРНК и активации клеток. В рамках доклинической программы были протестированы различные параметры редактирования и их комбинации, что позволило определить условия, обеспечивающие наилучший баланс эффективности и безопасности процедуры для ГСК.

CCR5-Uco-TALEN была спроектирована с использованием специализированных вычислительных инструментов, позволяющих заранее оценить специфичность нуклеазы и минимизировать риск нецелевых эффектов.

Лабораторный протокол редактирования CCR5 в Т-лимфоцитах с использованием электропорации мРНК CCR5-Uco-TALEN был разработан в Медицинском центре Университета Гамбург-Эппендорф, где и проводились ключевые доклинические исследования в отношении специфической активности in vitro и in vivo. В этих исследованиях было показано, что выключение CCR5 эффективно, воспроизводимо и обеспечивает выраженную защиту иммунных клеток от CCR5-тропных штаммов ВИЧ, а также даёт им селективное преимущество в присутствии вируса.

Высокоэффективный нокаут мишени CCR5 в гемопоэтических стволовых клетках при низкой нецелевой активности

Нуклеаза CCR5-Uco-TALEN обеспечивает эффективное и безопасное выключение гена CCR5 в иммунных и стволовых клетках, защищая их от ВИЧ без потери жизнеспособности и с минимальным риском нецелевых мутаций.

активность TALEN:
ЭФФЕКТИВНОСТЬ РЕДАКТИРОВАНИЯ CCR5 В ГСК
И Т-КЛЕТКАХ, СПЕЦИФИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ

Применяя инструменты редактирования важно учитывать, что их доставка в ГСК может запускать внутриклеточные иммунные механизмы и потенциально влиять на жизнеспособность клеток. Поэтому в рамках доклинических исследований особое внимание уделялось оценке того, сохраняют ли отредактированные гемопоэтические стволовые клетки свои ключевые функциональные свойства.

Для этого применялись стандартные методы, позволяющие оценить способность CD34+ клеток к делению, образованию колоний и дальнейшей дифференцировке в клетки крови. Сравнение отредактированных клеток с контрольными образцами показало, что при оптимально подобранных условиях трансфекции функциональная активность гемопоэтических стволовых клеток сохраняется.

Использование мРНК CCR5-Uco-TALEN позволяет эффективно редактировать ген CCR5 без утраты способности гемопоэтических стволовых клеток к восстановлению кроветворения.

БЕЗОПАСНОСТЬ IN VITRO: КОЛОНИЕОБРАЗУЮЩАЯ СПОСОБНОСТЬ ОТРЕДАКТИРОВАННЫХ ГСК

Для оценки нецелевой активности нуклеазы CCR5-Uco-TALEN был проведён анализ наиболее вероятных участков генома, предсказанных с использованием специализированных вычислительных инструментов. Проверка выполнялась на первичных гемопоэтических стволовых клетках человека при различных условиях культивирования и трансфекции, что позволило сравнить влияние параметров протокола на точность редактирования.

Анализ показал, что вне локуса гена CCR2, являющегося наиболее близким гомологом CCR5, признаки редактирования в других предсказанных участках генома не выявлялись. Проверка данных, дополнительным скрининговым аналитическим методом цифровой капельной ПЦР в локусе CCR2, подтвердила корректность оценки и надёжность достигнутого эффекта. Генетические изменения в локусе CCR2 не несут каких-либо известных или предсказуемых рисков. Это указывает на то, что при выбранных условиях редактирования риски, ассоциированные с нецелевой активностью CCR5-Uco-TALEN, минимальны.

При клиническом применении генного редактирования ключевое значение имеет контроль нецелевой активности, поскольку нежелательные разрывы ДНК в других участках генома потенциально могут быть связаны с генетической нестабильностью и онкогенными рисками. Поэтому одной из центральных задач доклинической программы AGCT стал подбор таких условий редактирования, при которых достигается эффективное выключение гена CCR5 при минимальном воздействии на другие участки генома.

Технология редактирования CCR5 по разработанному протоколу AGCT высокоэффективна и применима в клиническом масштабе

Редактирование CCR5-Uco-TALEN ограничено геном CCR5 и не затрагивает другие участки, кроме CCR2. Сходимость данных разных методов подтверждает надёжность эффекта

БЕЗОПАСНОСТЬ IN VITRO: ОЦЕНКА НЕЦЕЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ МЕТОДОМ ГЛУБОКО ТАРГЕТНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ

Поскольку прямое применение метода к первичным гемопоэтическим стволовым клеткам оказалось технически ограниченным, анализ был выполнен на валидной модельной клеточной линии, широко используемой в исследованиях ГСК. Результаты показали, что, помимо целевого гена CCR5, сигналы редактирования выявляются преимущественно в некодирующих или интронных областях генома, а единственным экзонным участком с воспроизводимой активностью остаётся близкородственный ген CCR2.

Для выявления возможной нецелевой активности вне заранее предсказанных участков был использован беспристрастный подход, основанный на анализе реальных двуцепочечных разрывов ДНК в клетках после редактирования. В качестве такого метода применялся TEG-seq — модифицированная версия GUIDE-seq, позволяющая обнаруживать сайты разрезов по всему геному без предварительных предположений о их расположении.

Сигналы редактирования за пределами CCR5 — только в некодирующих областях и гене CCR2

Полногеномный анализ TEG-seq подтверждает: редактирование ограничено целевым геном CCR5 и близкородственным CCR2.

БЕЗОПАСНОСТЬ IN VITRO: ОБЪЕКТИВНЫЙ ПОИСК НЕЦЕЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ МЕТОДОМ TEG-SEQ

В эксперименте сравнивали исходы ксеногенной трансплантации прототипа AGCT-001 и контрольных немодифицированных ГСК, оценивая приживление и восстановление популяций человеческих иммунных клеток в периферической крови, костном мозге и селезёнке. Результаты показали сопоставимое приживление и формирование основных иммунных субпопуляций без различий по клиническим наблюдениям между группами.

Ключевой задачей доклинической программы была проверка того, что отредактированные CD34+ гемопоэтические стволовые клетки сохраняют способность к приживлению и формируют полноценное мультилинейное кроветворение, включая иммунные клетки-мишени ВИЧ. Такая оценка требует ксенотрансплантационной модели in vivo. Исследования были выполнены совместно с зарубежным партнёром The Jackson Laboratory на «золотом стандарте» — иммунодефицитных мышах линии NSG, широко используемых в программах генной терапии ВИЧ.

Отредактированные CD34+ клетки приживаются и восстанавливают кроветворение наравне с немодифицированными, формируя все ключевые иммунные субпопуляции

Исследование на иммунодефицитных мышах NSG подтверждает сохранение функциональности отредактированных стволовых клеток.

Приживление ГСК после редактирования in vivo

безопасность AGCT-001 in vivo

Онкогенность и опухолевый потенциал
В течение всего периода наблюдения не выявлено признаков опухолевого роста или злокачественной трансформации клеток человека. Гистологический анализ тканей не показал патологической инфильтрации или формирования неопластических очагов, связанных с трансплантированными клетками. Поведение отредактированных ГСК in vivo не отличалось от немодифицированных клеток по параметрам, связанным с риском туморогенности.

Биораспределение и приживление
После трансплантации AGCT-001 было зафиксировано устойчивое приживление человеческих CD34+ клеток и их производных. В периферической крови, костном мозге и селезёнке выявлялись основные популяции человеческих иммунных клеток. Распределение клеток соответствовало физиологическому восстановлению .

Токсичность
В ходе длительного наблюдения после трансплантации AGCT-001 не отмечалось ухудшения общего состояния животных по сравнению с контрольной группой. Клинические параметры, выживаемость и динамика массы тела оставались сопоставимыми у животных, получивших отредактированные и немодифицированные ГСК. Признаков системной токсичности, связанных с процедурой генного редактирования или трансплантацией продукта, выявлено не было.

Признаков системной токсичности, опухолевого роста или патологических изменений не выявлено. Поведение отредактированных клеток не отличалось от немодифицированных.

Исследования токсичности, биораспределения, приживления и туморогенности были выполнены ФГБОУ ВО ПСПбГМУ им. И.П.Павлова Минздрава России на базе вивария ФГБУ «НМИЦ им. В. А. Алмазова» Минздрава России с использованием in vivo модели иммунодефицитных мышей NBSGW.

И подтвердили отсутствие нежелательных эффектов, устойчивое приживление клеток и сохранение физиологического кроветворения.

мы будем делится свежими исследованиями, сейчас вы можете подробней узнать о технологии AGCT

Хотите узнать больше о проекте или обсудить партнёрство? Заполните форму или напишите нам в мессенджеры — ответим в ближайшее время.

у вас появились вопросы?