исследования agct

Данные доклинических испытаний подтверждают потенциал технологии.

При этом доставка нуклеазы в виде мРНК не нарушает жизнеспособность и функциональность ни Т-лимфоцитов, ни гемопоэтических стволовых клеток, а уровень нецелевой активности остаётся низким и контролируемым, что подтверждает благоприятный профиль безопасности и клиническую применимость данного подхода.

Лабораторный протокол редактирования CCR5 с использованием электропорации мРНК CCR5-Uco-TALEN был разработан и отработан в Медицинском центре Университета Гамбург-Эппендорф, где и проводились ключевые доклинические исследования. В этих исследованиях было показано, что выключение CCR5 эффективно, воспроизводимо и обеспечивает выраженную защиту иммунных клеток от CCR5-тропных штаммов ВИЧ, а также даёт им селективное преимущество в присутствии вируса.

CCR5-Uco-TALEN была спроектирована с использованием специализированных вычислительных инструментов, позволяющих заранее оценить специфичность нуклеазы и минимизировать риск нецелевых эффектов. На этапе разработки были проанализированы потенциальные участки нежелательного связывания, включая близкородственные гены, что подтвердило высокую избирательность инструмента именно к гену CCR5 человека.

Высокая избирательность инструмента именно
к гену CCR5 человека

Нуклеаза CCR5-Uco-TALEN обеспечивает эффективное и безопасное выключение гена CCR5 в иммунных и стволовых клетках, защищая их от ВИЧ без потери жизнеспособности и с минимальным риском нецелевых мутаций.

активность TALEN
в отношении
Т-клеток

Сходимость данных, полученных разными аналитическими методами, подтвердила корректность оценки и надёжность достигнутого эффекта. В совокупности это свидетельствует о том, что технология редактирования CCR5 в рамках AGCT хорошо контролируема, воспроизводима и пригодна для дальнейшего клинического применения.

Эффективность выключения гена CCR5 оценивалась с использованием независимых высокоточных методов молекулярного анализа, позволяющих надёжно фиксировать внесённые изменения в геноме. Полученные результаты показали, что оптимизированный протокол обеспечивает стабильно высокий и воспроизводимый уровень редактирования CCR5 в гемопоэтических стволовых клетках.

В ходе развития технологии AGCT протокол генного редактирования гемопоэтических стволовых клеток был последовательно оптимизирован с учётом современных подходов к электропорации, работе с мРНК и активации клеток. В рамках доклинической программы были протестированы различные параметры редактирования и их комбинации, что позволило определить условия, обеспечивающие наилучший баланс эффективности и безопасности.

Сходимость данных разных методов подтверждает надёжность эффекта

Оптимизированный протокол редактирования AGCT обеспечивает стабильно высокий и воспроизводимый уровень выключения гена CCR5 в стволовых клетках, подтверждённый независимыми методами анализа, что делает технологию контролируемой и готовой к клиническому применению.

Эффективность редактирования CCR5

Колониеобразующая способность

Для этого применялись стандартные и хорошо валидированные методы, позволяющие оценить способность CD34+ клеток к делению, образованию колоний и дальнейшей дифференцировке. Сравнение отредактированных клеток с контрольными образцами показало, что при оптимально подобранных условиях трансфекции функциональная активность гемопоэтических стволовых клеток сохраняется.

При работе с экзогенной мРНК важно учитывать, что она может запускать внутриклеточные иммунные механизмы и потенциально влиять на жизнеспособность клеток. Поэтому в рамках доклинических исследований особое внимание уделялось оценке того, сохраняют ли отредактированные гемопоэтические стволовые клетки свои ключевые функциональные свойства.

Использование мРНК CCR5-Uco-TALEN позволяет эффективно редактировать ген CCR5 без утраты способности клеток к восстановлению кроветворения.

Особое внимание было уделено анализу гена CCR2, являющегося наиболее близким гомологом CCR5 и, следовательно, потенциальной мишенью нецелевого действия нуклеазы. Для оценки этого риска использовался высокочувствительный молекулярный метод, позволяющий надёжно выявлять даже редкие события редактирования в заданных локусах. Полученные результаты показали, что при оптимизированных условиях трансфекции уровень нецелевой активности остаётся низким и контролируемым.

При клиническом применении генного редактирования ключевое значение имеет контроль нецелевой активности, поскольку нежелательные разрывы ДНК в других участках генома потенциально могут быть связаны с генетической нестабильностью и онкогенными рисками. Поэтому одной из центральных задач доклинической программы AGCT стал подбор таких условий редактирования, при которых достигается эффективное выключение гена CCR5 при минимальном воздействии на другие участки генома.

Уровень нецелевой активности остаётся низким и контролируемым

Подобраны условия редактирования, эффективно выключающие CCR5 с минимальным воздействием на другие участки генома.

Частота нецелевой активности при оценке методом ddPCR

Анализ показал, что вне локуса гена CCR2, являющегося наиболее близким гомологом CCR5, признаки редактирования в других предсказанных участках генома не выявлялись. Это указывает на то, что при выбранных условиях редактирование ограничивается целевой областью и не затрагивает посторонние генетические локусы.

Для оценки нецелевой активности нуклеазы CCR5-Uco-TALEN был проведён анализ наиболее вероятных участков генома, предсказанных с использованием специализированных вычислительных инструментов. Проверка выполнялась на первичных гемопоэтических стволовых клетках человека при различных условиях культивирования и трансфекции, что позволило сравнить влияние параметров протокола на точность редактирования.

Редактирование ограничивается целевой областью и не затрагивает посторонние генетические локусы

Редактирование CCR5-Uco-TALEN ограничено геном CCR5 и не затрагивает другие участки, кроме CCR2.

оценка методом глубоко таргетного  секвенирования

Поскольку прямое применение метода к первичным гемопоэтическим стволовым клеткам оказалось технически ограниченным, анализ был выполнен на валидной модельной клеточной линии, широко используемой в исследованиях ГСК. Результаты показали, что помимо целевого гена CCR5 сигналы редактирования выявляются преимущественно в некодирующих или интронных областях генома, а единственным экзонным участком с воспроизводимой активностью остаётся близкородственный ген CCR2.

Для выявления возможной нецелевой активности вне заранее предсказанных участков был использован беспристрастный подход, основанный на анализе реальных двуцепочечных разрывов ДНК в клетках после редактирования. В качестве такого метода применялся TEG-seq — модифицированная версия GUIDE-seq, позволяющая обнаруживать сайты разрезов по всему геному без предварительных предположений о их расположении.

Сигналы редактирования за пределами CCR5 — только в некодирующих областях и гене CCR2

Полногеномный анализ TEG-seq подтверждает: редактирование ограничено целевым геном CCR5 и близкородственным CCR2.

Объективный поиск нецелевой активности методом TEG‑seq

В эксперименте сравнивали исходы трансплантации прототипа AGCT-001 и контрольных немодифицированных ГСК, оценивая приживление и восстановление популяций человеческих иммунных клеток в периферической крови, костном мозге и селезёнке. Результаты показали сопоставимое приживление и формирование основных иммунных субпопуляций, включая CD4+ Т-лимфоциты и моноциты/макрофаги, без различий по клиническим наблюдениям между группами.

Ключевой задачей доклинической программы была проверка того, что отредактированные CD34+ гемопоэтические стволовые клетки сохраняют способность к приживлению и формируют полноценное мультилинейное кроветворение, включая иммунные клетки-мишени ВИЧ. Такая оценка требует ксенотрансплантационной модели in vivo, поскольку надёжных in vitro протоколов дифференцировки ГСК/ГКП в Т-лимфоциты на сегодня не существует. Поэтому исследования были выполнены совместно с зарубежным партнёром The Jackson Laboratory на «золотом стандарте» — иммунодефицитных мышах линии NSG, широко используемых в программах генной терапии ВИЧ.

Отредактированные CD34+ клетки приживаются и восстанавливают кроветворение наравне с немодифицированными, формируя все ключевые иммунные субпопуляции, включая CD4+ Т-лимфоциты и моноциты.

Исследование на иммунодефицитных мышах NSG подтверждает сохранение функциональности отредактированных стволовых клеток.

Приживление ГСК после редактирования in vivo

безопасность AGCT-001 in vivo

Онкогенность и опухолевый потенциал
В течение всего периода наблюдения не выявлено признаков опухолевого роста или злокачественной трансформации клеток человека. Гистологический анализ тканей не показал патологической инфильтрации или формирования неопластических очагов, связанных с трансплантированными клетками. Поведение отредактированных ГСК in vivo не отличалось от немодифицированных клеток по параметрам, связанным с онкогенным риском.

Биораспределение и приживление
После трансплантации AGCT-001 было зафиксировано устойчивое приживление человеческих CD34+ клеток и их производных. В периферической крови, костном мозге и селезёнке выявлялись основные популяции человеческих иммунных клеток, включая Т-лимфоциты и клетки миелоидного ряда. Распределение клеток соответствовало физиологическому восстановлению кроветворения и не отличалось от контрольных образцов.

Токсичность
В ходе длительного наблюдения после трансплантации AGCT-001 не отмечалось ухудшения общего состояния животных по сравнению с контрольной группой. Клинические параметры, выживаемость и динамика массы тела оставались сопоставимыми у животных, получивших отредактированные и немодифицированные ГСК. Признаков системной токсичности, связанных с процедурой генного редактирования или трансплантацией продукта, выявлено не было.

Признаков системной токсичности, опухолевого роста или патологических изменений не выявлено. Поведение отредактированных клеток не отличалось от немодифицированных

Исследования токсичности, биораспределения, приживления и онкогенного потенциала продукта AGCT-001 были выполнены в ФГБУ «НМИЦ им. В. А. Алмазова» Минздрава России с использованием in vivo модели иммунодефицитных мышей.

И подтвердили отсутствие нежелательных эффектов, устойчивое приживление клеток и сохранение физиологического кроветворения.

мы будем делится свежими исследованиями, сейчас вы можете подробней узнать о технологии AGCT

Хотите узнать больше о проекте или обсудить партнёрство? Заполните форму или напишите нам в мессенджеры — ответим в ближайшее время.

у вас появились вопросы?