crispr cas

Система CRISPR-Cas9 позволяет высокоточно и универсально редактировать гены. Она состоит из двух ключевых компонентов: гидовой РНК (гРНК), «нацеленной» на ген, который нужно отредактировать, и белка Cas9, способного разрезать ДНК.

С помощью гидовой РНК Cas9 направляется к нужной, целевой последовательности и делает в ДНК двунитевой разрыв (Рис. 1Г). После этого ученые направляют «застройку» разрыва по одному из путей. Первый — нарушает последовательность гена и, таким образом, «выключает» его. Второй — заменяет ген другой последовательностью ДНК: например, мутантный вариант меняет на нормальный.
Однако редактирование ДНК через ее разрезание может нарушить структуру и стабильность генома. Так, разрывы могут быть внесены не только в целевую последовательность ДНК, но и в другие места — это называют «off target» эффектом. Кроме этого, изменения ДНК необратимы.

Рис. 1. CRISPR-dCas9 и CRISPR-Cas9. «Мертвый» Cas9 с присоединенным белком-активатором (А) или репрессором (Б) с помощью гидовой РНК направляется на промотор, или начало, гена и, соответственно, включает или выключает его.
В — Индуцируемый CRISPR-dCas. dCas9 можно «соединить» с переключателем, который «отвечает» на свет. Г — Обычный Cas9 с помощью гидовой РНК направляется к региону интереса и вносит разрыв в ДНК. https://www.bio-rad.com/, с изм.

Поэтому ученые убили модифицировали белок Cas9, создав каталитически неактивный — «мертвый» — Cas9, или dCas9 (от «dead»). У «мертвого» Cas9 инактивирован домен, отвечающий за разрезание ДНК. Но хотя dCas9 не может вносить разрывы, он по-прежнему специфично связывается с целевой последовательностью ДНК. А вместо необратимого изменения генома, связывание dCas9 обратимо подавляет активность гена-мишени. При этом обычно dCas9 работает не в одиночку, а «в команде» с другими белками. Например, к нему можно «привязать» белки-регуляторы: активаторы или репрессоры — и «включать» и «выключать» активность генов без нарушения их последовательности! (Рис.1 А,Б)

Другими словами, dCas9 позволяет вносить изменения не на уровне ДНК, генома, а на более высоком уровне — эпигенома. Эпигеном («эпи» — от греческого «над») — это набор молекулярных меток, которые регулируют активность гена, определяя: будет ли ДНК доступна для белков и активна или будет свернута и неактивна. Эти метки включают в себя химическую модификацию самой ДНК — ее метилирование — и различные модификации гистонов — белков, на которые «намотана» ДНК. При этом саму последовательность ДНК метки не затрагивают. Это значит, что регуляция на уровне эпигенома наследуемая, но обратимо изменяемая.

Редактирование эпигенома несет огромный потенциал как для научных исследований, так и для разработки терапевтических подходов. С его помощью можно эффективнее изучать функции генов и регуляторных генетических элементов, а также создавать препараты для подавления встроившегося в ДНК вируса, поддержания иммунитета, борьбы с раком. Однако доступные сегодня «эпигенетические» лекарства неизбирательны и действуют сразу на весь эпигеном.

«Мертвый» Cas, наоборот, производит эпигенетические манипуляции точечно. Его можно «связать» с любым белком-эффектором — будь то регулятор активности генов или модификатор гистонов или метилирования ДНК — и «нацелить» на нужный геномный регион так же, как обычный Cas9 [1]. Однако вместо того, чтобы разрезать ДНК, комплекс dCas9 с эффектором будет модифицировать эпигеном в этом регионе.

Способов редактирования эпигенома с помощью dCas огромное множество, и одной регуляцией активности генов все не ограничивается.

1. Включать ген «по команде»
«Сочетание» dCas9 с белками-активаторами позволяет обратимо активировать ген в десятки и даже тысячи раз, а с репрессорами — подавлять в 5–10 раз. Более того, с помощью «мертвого» Cas можно «запускать» работу гена «по команде» — например, в ответ на облучение синим светом [2]. Для этого достаточно добавить в систему специальных белков, «реагирующих на свет». После облучения они «присоединяют» к dCas9 белок-активатор — и ген включается (Рис. 1В). Таким способом можно контролировать работу генов в пространстве и времени.

2. Редактировать метилирование ДНК
Еще «мертвый» Cas можно использовать для избирательного введения или удаления метилирования ДНК. Для этого достаточно «соединить» dCas9 с нужными ферментами [3] (Рис. 2А).

Метилирование ДНК обычно происходит в участке ДНК непосредственно перед геном, который нужно «отключить», — в его промоторе. Это важный механизм подавления генов, который играет большую роль в развитии и старении организма, дифференцировке клеток. А его нарушения связаны с заболеваниями, например, раком. Вероятность развития опухоли увеличивается, если метилирование «снимается» с онкогенов или, наоборот, появляется на генах-онкосупреcсорах.

Все эти нарушения можно исправить с помощью dCas9. Подход уже показал хорошие результаты на клеточных моделях разных типов рака. Например, удалось восстановить работу гена-онкосупрессора BRCA1 на модели рака молочной железы [4], исправить клинические проявления синдрома ломкой X-хромосомы [5] и уменьшить активность протоонкогена MYC в опухолевых клетках [6].

Рис. 2. CRISPR-dCas9 для редактирования метилирования ДНК (А) и «гистонового кода» (Б). https://www.addgene.org/crispr/epigenetics/, с изм.

3. «Переписывать» гистоновый код
Гистоны — это небольшие белки, на которые, как на катушки, наматывается ДНК. Они подвергаются многочисленным химическим модификациям, каждая из которых несет свое сигнальное значение. Одни «гистоновые метки» способствуют активации генов, другие — репрессии, третьи «помечают» регуляторные элементы в ДНК, четвертые сигнализируют о «поломке». Эти «метки» вносят специальные белки, а зависит это от «нужд» клетки в данный момент. Из-за такой сложной регуляции набор модификаций гистонов называют «гистоновым кодом».

«Мертвый» Cas позволяет точечно менять гистоновый код рядом с целевой последовательностью ДНК. Например, dCas9 можно связать с белком, вносящим «активирующую» метку в гистоны — ацетилирование — и повысить активность гена в 50–10000 раз [7] (Рис. 2Б). По аналогичному принципу ген можно выключить.

4. «Зажигать» хроматин
Еще одно «красивое» применение «мертвого» Cas — визуализация выбранных регионов хромосом, причем, в отличие от других методов, прямо в живых клетках. Для этого dCas «соединяют» с флуоресцентной меткой и с помощью специфичной гидовой РНК направляют к региону интереса.
Метод позволяет «зажечь» разными цветами несколько регионов сразу и отследить их динамику во времени. Для мечения нескольких регионов светящиеся метки «крепят» не к самому Cas, а к гидовым РНК, каждая из которых направляется к своему региону и «зажигает» его определенным цветом. Например, в одном из исследований красным и зеленым цветом пометили два разных типа повторяющихся последовательностей ДНК и наблюдали за их положением в ядре на протяжении клеточного цикла [8] (Рис. 3).

Рис. 3. А — dCas9 в комплексе с гидовой РНК, несущей зеленую или красную флуоресцентную метку. Каждая из гидовых РНК специфически связывает свой тип повторяющихся последовательностей ДНК. Б — Фотографии клеток на разных стадиях митоза, полученные с помощью таймлапс-флуоресцентной микроскопии. [6, с изм.]

5. Собирать «жидкие капли» на хроматине
Поскольку «мертвый» Cas позволяет создавать самые разные платформы из белков-эффекторов, это открывает практически неограниченные возможности для изменения эпигенома. Например, в недавнем исследовании представили метод LAMPS для сборки на хроматине «жидких капель», или биомолекулярных конденсатов, под действием синего света [9]. Дело в том, что многие процессы в клетке сопровождаются сборкой комплексов, состоящих из белков и других молекул и имеющих жидкую природу — биомолекулярных конденсатов. Конденсаты только начинают изучать, но уже ясно, что они задействованы практически во всех биохимических процессах в клетке, таких как «считывание» мРНК с генов, передача сигнала внутри клетки, «ремонт» повреждений в ДНК [10]. А один из способов изучать «жидкие капли» — это как раз «собирать» их искусственно и проверять, какие изменения это вызывает в клетке.

С помощью метода LAMPS ученые искусственно «запустили» сборку таких «капель» на изначально неактивных генах. Для этого к «мертвому» Cas «прикрепили» белок, «реагирующий» на синий свет, и белок, «притягивающий» остальные компоненты будущего конденсата. Кроме этого, добавили красную флуоресцентную метку, чтобы сборку «капель» отследить в микроскоп. После облучения синим светом в клетке, как красные лампочки, начинали загораться конденсаты (Видео, Рис. 4). Оказалось, что сборка таких «капель» привела к активации генов и к сильному изменении структуры хроматина вокруг них. Именно так «мертвый» Cas помог понять роль жидких «капель» в активации генов.

Видео: под действием синего света в клетках начинают собираться «жидкие капли», помеченные красной флуоресцентной меткой. Видео из статьи [11], где применяли похожий на LAMPS метод. В данном случае «капли» собираются не только на хроматине, но и во всей клетке.

Рис. 4. «Жидкие капли» в клетках. Микрофотография автора статьи, полученная с помощью похожего на LAMPs метода (Лаборатория структурно-функциональной организации хромосом, ИБГ РАН).

«Убийство» Cas9, точнее, лишение его способности резать ДНК, оказалось блестящей идеей! «Мертвый» Cas позволяет проводить практически любые обратимые манипуляции хроматином. На его основе также созданы и высокоточные редакторы оснований, которые позволяют заменить в ДНК всего одну букву, и инструменты для редактирования РНК, и сложные системы для изучения хроматина. dCas уже сделал исследования генома и эпигенома эффективнее, а в ближайшем будущем сможет стать мощным инструментом для создания терапевтических препаратов.