ГЕНОМ В 3D: НА ЧТО ВЛИЯЕТ «ФОРМА» ГЕНОМА И КАК ЕЙ УПРАВЛЯЮТ СЕГОДНЯ

8 августа 2024

Автор: Мария Молодова

раскопки мамонта

Введение

Полная длина ДНК всех хромосом человека — 1,8 м, а диаметр ядра, в котором они находятся — 0,000006 м. Как же ДНК такой длины умещается в таком микроскопическом объеме, еще и продолжая правильно работать, «включая» только нужные гены? Об этом расскажет 3D-геномика — наука о пространственной организации, или упаковке, ДНК в ядре [1]. Из статьи вы узнаете, какими методами сегодня изучают 3D-структуру геномной ДНК, как пространственная организация генома контролирует работу генов, а также о заболеваниях, к которым приводят ее нарушения.
О том, что ДНК в ядре расположена компактно, было известно давно, а вот сами уровни ее организации долго оставались загадкой. Не вызывали сомнения лишь первый и последний уровни упаковки.

На самом первом уровне, нуклеосомном, двойная спираль ДНК дважды оборачивается вокруг «сердцевины» из специальных белков — гистонов. Так образуются похожие на «бусины» нуклеосомы. Между «бусинами» видна нить ДНК, поэтому такую структуру часто называют «бусины на нити» (Рис. 1).

Самый высокий уровень упаковки представлен хромосомами. Хромосомы состоят из хроматина — комплекса ДНК и ассоциированных с ней белков и РНК. На картинках их часто изображают в виде плотных, Х-образных структур. Но в таком виде они находятся лишь короткое время, в одну из фаз деления клетки. В основной период «жизни» клетки, когда она не делится, форма хромосом рыхлая и напоминает спагетти (Рис. 1), что делает хромосомы более доступными для действия белков-регуляторов.

Из-за отсутствия подходящих методов промежуточные уровни упаковки ДНК долгое время приходилось изучать не в живой клетке, а in vitro (в искусственных условиях). А поскольку в растворе ДНК ведет себя по-другому, такие эксперименты иногда приводили к ошибочным представлениям. Это мешало ученым разобраться в деталях регуляции работы генов и других процессов внутри ядра.

Секрет упаковки ДНК

Рис. 1. Представления об уровнях упаковки ДНК в ядре [4]. Двойная спираль ДНК «оборачивается» вокруг гистонов, образуя нуклеосомы. Нуклеосомы соединены участками свободной ДНК, формируя нуклеосомную фибриллу (структура «бусины на нити»). Раньше считалось, что она, в свою очередь, сворачивается в «30-нанометровую фибриллу», а сейчас это уже миф. Последний уровень упаковки ДНК представлен хромосомами.
В первой половине XX века организацию генома изучали на уровне хромосом, в основном с помощью микроскопа. Рассматривая ядра клеток под микроскопом, ученые увидели темные области более плотного гетерохроматина и светлые — более рыхлого эухроматина [5] (Рис. 2). Эухроматин связан в основном с активными генами, а гетерохроматин с молчащими.

Теперь мы понимаем, что в рыхлый, «развернутый» эухроматин могут легко зайти белки, обеспечивающие работу генов, и, наоборот, плотно упакованный гетерохроматин оказывается для них недоступным [6]. Вот она — первая связь между «формой» и функцией генома!

Дела давно минувших дней…

С 80-х годов и до недавнего времени представления о промежуточных уровнях упаковки хроматина основывались, как уже говорилось, на экспериментах in vitro. Ученые считали, что структура «бусины на нити» образует еще одну спираль [1; 2] — получается такая «спираль внутри спирали», а та, в свою очередь, сворачивается в гигантские петли [3]. Сейчас эти представления устарели, хотя продолжают встречаться в книгах по биологии. Оказалось, что хроматин в живой клетке организован совершенно иначе.
Рис. 2.
Клетка под электронным микроскопом: внутри ядра видны темные области более плотного гетерохроматина и светлые – более рыхлого эухроматина [8].
В 80-е годы «арсенал» ученых пополнился методом FISH. В отличие от обычной микроскопии, которая показывает «общий вид» хроматина (Рис. 2), этот метод позволяет различить конкретные гены или хромосомы и определить их положение в ядре. Также с помощью FISH можно количественно оценить пространственную близость двух выбранных участков генома [7].

Целевой участок ДНК избирательно «метят» с помощью искусственно синтезированного флуоресцентного ДНК-зонда, комплементарного этому участку (Рис. 3). После того как флуоресцентный зонд связывается с участком-мишенью в ядре клетки, его можно увидеть под флуоресцентным микроскопом.

FISH, или как «раскрасить» ДНК

Рис. 3.
Схема эксперимента FISH для визуализации региона интереса в ядре. В данном случае хромосомы имеют Х-образную форму, так как клетки фиксировали на стадии деления. Но FISH можно делать и на других стадиях «жизни» клетки.
1. Вначале под выбранный участок ДНК, например, ген или хромосому, создают специальный зонд. Зонд представляет собой искусственно синтезированный в лаборатории «кусочек» одноцепочечной ДНК, комплементарный участку интереса. Его флуоресцентно метят определенным цветом.
2. Клетки помещают на стекло и с помощью специальных реагентов фиксируют, чтобы хроматин сохранял исходную «форму» и не разваливался во время манипуляций. А мембрану, то есть оболочку клетки, «дырявят».
3. После этого к клеткам на стекле добавляют зонд, и он проникает в ядро клеток. Препарат нагревают, чтобы из двух цепочек ДНК в клетках «расплелась» до одной.
4. Наконец, температуру понижают, и происходит гибридизация — комплементарное связывание — зонда с участком интереса. Осталось только «проявить изображение» с помощью флуоресцентного микроскопа!
Под микроскопом участок светится определенным цветом в зависимости от того, как именно был мечен зонд. С помощью нескольких зондов разных «цветов» можно «раскрасить» несколько участков сразу, а затем анализировать расстояние между ними, их расположение в ядре (Рис. 4Б-В). Причем визуализировать можно как мелкие регионы, например, отдельные гены (Рис. 4Б), так и целые хромосомы (Рис. 4В).

Помимо науки, FISH используется в медицине для выявления хромосомных аномалий [10], например, отсутствия какой-либо хромосомы или наличия «лишней».
Метод FISH позволяет определить расположение в пространстве двух-трех участков генома, но можно ли сделать это сразу для множества мелких кусочков хромосом? Детальное изучение карты генома стало возможным в 2009 году с появлением самого эффективного на сегодняшний день метода 3D-геномики — Hi-C («хай-си») [11]. Именно С-методы, к которым относится Hi-C, способствовали становлению 3D-геномики как отдельной области науки.

Hi-C позволяет получить карту пространственных взаимодействий для всего генома. Этот метод — возможно, самый сложный и многоступенчатый и в то же время самый элегантный в молекулярной биологии (Рис. 5). Hi-C основан на том, что сближенные в пространстве участки ДНК можно искусственно «сшить» в одну молекулу, а потом «прочитать» и посчитать все такие «объединенные» молекулы [11]. Например, если «синий» и «красный» участки на Рис. 5 формировали контакт в ядре живой клетки, в ходе эксперимента они «сошьются» в единую «сине-красную» молекулу – и чем больше таких молекул обнаружится, тем чаще эти участки контактировали в пространстве в ядре клетки.

Hi-C и карта 3D-генома

Рис. 5. Схема эксперимента Hi-C.
Так анализируют попарные расстояния между всеми фрагментами генома и строят тепловую карту взаимодействий. Карта выглядит как квадратная матрица, где по горизонтали и вертикали отложен геном, последовательно разбитый на небольшие кусочки определенной длины (Рис. 6.). Каждая строка и столбец соответствует определенному фрагменту генома.

В квадратике-пикселе на пересечении каждой строки и столбца отображают число контактов между соответствующими фрагментами в цветовой шкале: чем ярче цвет, тем больше контактов. Полученная карта симметрична относительно диагонали, и, если ее «разрезать» вдоль диагонали и перевернуть, получится треугольное отображение, которое иногда тоже используют.
Рис. 6. Карта Hi-C. Для простоты на рисунке изображены не все хромосомы, а только одна.
Рассматривая такую карту в разных масштабах, можно наблюдать характерные рисунки, соответствующие разным уровням упаковки ДНК. И так же, как с уменьшением масштаба в Google картах жилые районы «схлопываются» в города, затем в страны, а затем и в целые континенты, на геномных картах Hi-C млекопитающих небольшие петли хроматина объединяются в плотные клубочки (по-научному, контактные домены), затем в области эу- и гетерохроматина, а затем в хромосомы (Рис. 7).
Рис. 7. Уровни упаковки генома на карте Hi-C [12; 13].
«Путешествуя» по картам Hi-C, ученые, прежде всего, «отслеживают положение» интересующих их генов в той или иной клетке: с какими генами или другими участками ДНК они «соседствуют» в пространстве, в каком контактном домене находятся, в эу- или гетерохроматине. Так можно больше узнать о регуляции работы этих генов и причинах ее нарушения в случае заболеваний.

На самом крупном масштабе можно увидеть маленькие яркие точки сбоку от диагонали и яркие квадраты вдоль диагонали. Яркие точки на светлом фоне карты соответствуют дальним контактам, или петлям хроматина. То есть два участка, которые на линейной «нити» хроматина расположены далеко, в пространстве сближаются, а фрагмент между ними изгибается – и образуется петля хроматина. А яркие квадраты вдоль диагонали представляют собой контактные домены. После получения первой карты Hi-C стало ясно, что контактный домен — это основная структурно-функциональная единица генома млекопитающих [16]. Этот уровень упаковки важен для регуляции «слаженной» работы генов.

Уменьшив масштаб, можно увидеть яркие квадраты не только вдоль диагонали, но и по всей карте — похоже на клетчатый плед. Эти квадраты отображают взаимодействующие в пространстве группы доменов. Наконец, хромосомы на карте выглядят как отдельные большие квадраты на светлом фоне — это каждая хромосома занимает в ядре отдельную «территорию» и почти не взаимодействует с другими хромосомами.
В клетках разных тканей на разных этапах развития организма должен работать «свой», строго определенный набор генов. Поэтому в клетке работа генов должна правильно регулироваться: в определенное время одни гены должны «включаться», а другие «выключаться». Нарушение регуляции вызывает заболевания, в том числе пороки развития и рак. В то же время регулировать работу десятков тысяч генов – невероятно сложная задача, которая «решается» на нескольких уровнях и с использованием разных механизмов.

В геноме кроме генов есть участки, регулирующие их работу: активирующие – энхансеры, и подавляющие – сайленсеры. Такие участки-регуляторы «умеют» находить подконтрольный ген в пространстве и взаимодействовать с ним, образуя петли хроматина. После этого энхансер может «включить», а сайленсер «выключить» целевой ген (Рис. 8). Поэтому хроматиновые петли важны для регуляции активности генов [17].

«Форма» и функция генома

Рис. 8. Взаимодействие энхансера с подконтрольным геном [18]. Если более точно — энхансер взаимодействует с промотором – участком непосредственно перед геном, откуда начинается «считывание» гена ферментом РНК-полимеразой.
Область действия энхансеров и сайленсеров обычно ограничена контактными доменами: регуляторы могут влиять на гены внутри домена, но не за его пределами [19]. А разделение соседних доменов в пространстве обеспечивает специальный «барьерный» белок CTCF, который «узнает» и связывает последовательность ДНК на границе доменов [20].
Рис. 9. А – мутации, вызывающие нарушения границы доменов. Б – примеры их последствий) [21; 22].
Если же по какой-то причине пространственное взаимодействие между геном и регулятором нарушается, это приводит к неправильной работе гена и к заболеваниям, включая как редкие наследственные, так и расстройства нервной системы, рак [22; 23]. Например, редкое генетическое заболевание, при котором разрушается белое вещество в мозге, или другое заболевание, когда укорачиваются конечности, возникают при «выпадении» участка на границе двух хроматиновых доменов (Рис. 9А). Из-за этого граница домена «стирается», и энхансеры из одного домена начинают влиять на ген из соседнего домена, слишком сильно его активируя. Похожий эффект наблюдается и при других генетических мутациях. Например, граница домена может «переместиться» при зеркальном «переворачивании» определенного участка ДНК — по такому механизму возникает скелетная дисплазия, то есть деформация скелета (Рис. 9Б).
Встает закономерный вопрос: можно ли исправить нарушения пространственной организации генома?

В теории можно выделить несколько стратегий по восстановлению правильных хроматиновых петель и доменов [23]. Одна из таких стратегий — редактирование последовательности ДНК с помощью CRISPR/Cas9 – технологии, позволяющей удалять, добавлять или изменять выбранные участки ДНК. Так, с помощью «генетических ножниц» CRISPR/Cas9 можно искусственно вырезать или вставлять границу контактного домена в нужное место в цепочке ДНК. Однако, как и любое редактирование ДНК, это сопряжено с риском хромосомных перестроек, что стоит учитывать [24].

Наиболее многообещающим и безопасным представляется редактирование ex vivo: когда поврежденные клетки забирают у пациента, подвергают манипуляциям в лаборатории и «подсаживают» назад в тело пациента. В будущем этот подход может использоваться для лечения ряда заболеваний органов кроветворения и эндокринной системы, а также некоторых мышечных дистрофий [23].

Сегодня вы узнали, что форма и функция тесно связаны не только в архитектуре зданий, но и в «архитектуре» ДНК внутри клеточного ядра. Наука о пространственной организации генома — 3D-геномика — за последнее десятилетие прошла длинный путь. Появление новых биохимических методов и вычислительных подходов для анализа данных позволило детально изучать пространственную структуру генома — на уровне отдельных генов. Исследования структуры хроматина помогают ученым разобраться в таких фундаментальных вопросах молекулярной биологии, как регуляция активности генов, и выявлять причины некоторых тяжелых генетических заболеваний.

Как управлять 3D-геномом?

1. Finch J.T. Solenoidal model for superstructure in chromatin. / J.T. Finch, A. Klug // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. – 1976. – Vol. 73. – № 6. – P. 1897-1901.

2. Wu C. A variable topology for the 30-nm chromatin fibre / C. Wu, A. Bassett, A. Travers // EMBO Reports. – 2007. – Vol. 8. – № 12. – P. 1129-1134.

3. Nuclear structure and the three-dimensional organization of DNA / R.H. Getzenberg [et al.] // Journal of Cellular Biochemistry. – 1991. – Vol. 47. – № 4. – P. 289-299.

4. Jansen A. Nucleosome Positioning in Saccharomyces cerevisiae / A. Jansen, K.J. Verstrepen // Microbiology and Molecular Biology Reviews : MMBR. – 2011. – Vol. 75. – № 2. – P. 301-320.

5. Schultz J. The Nature of Heterochromatin / J. Schultz // Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. – 1947. – Vol. 12. – P. 179-191.

6. Morrison O. Molecular Complexes at Euchromatin, Heterochromatin and Centromeric Chromatin / O. Morrison, J. Thakur // International Journal of Molecular Sciences. – 2021. – Vol. 22. – № 13. – P. 6922.

7. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes / M. Cremer [et al.] // Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). – 2008. – Vol. 463. – P. 205-239.

8. Pyrrolidine Dithiocarbamate (PDTC) Inhibits DON-Induced Mitochondrial Dysfunction and Apoptosis via the NF-κB/iNOS Pathway / D. Wan [et al.] // Oxidative Medicine and Cellular Longevity. – 2018. – Vol. 2018. – P. 1324173.

9. Trisomies Reorganize Human 3D Genome / I.V. Zhegalova [et al.] // International Journal of Molecular Sciences. – 2023. – Vol. 24. – № 22. – P. 16044.

10. Тарасов Ю. От хромосом к молекулам: молекулярная цитогенетика [Электронный ресурс]. – URL: https://biomolecula.ru/articles/ot-khromosom-k-molekulam-molekuliarnaia-tsitogenetika .

11. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome / E. Lieberman-Aiden [et al.] // Science (New York, N.Y.). – 2009. – Vol. 326. – № 5950. – P. 289-293.

12. Seeing the forest through the trees: prioritising potentially functional interactions from Hi-C / N. Liu [et al.] // Epigenetics & Chromatin. – 2021. – Vol. 14. – Seeing the forest through the trees. – P. 41.

13. Juicebox Provides a Visualization System for Hi-C Contact Maps with Unlimited Zoom / N.C. Durand [et al.] // Cell systems. – 2016. – Vol. 3. – № 1. – P. 99-101.

14. TADs are 3D structural units of higher-order chromosome organization in Drosophila / Q. Szabo [et al.] // Science Advances. – 2018. – Vol. 4. – № 2. – P. eaar8082.

15. Heterochromatin drives compartmentalization of inverted and conventional nuclei / M. Falk [et al.] // Nature. – 2019. – Vol. 570. – № 7761. – P. 395-399.

16. Topological Domains in Mammalian Genomes Identified by Analysis of Chromatin Interactions / J.R. Dixon [et al.] // Nature. – 2012. – Vol. 485. – № 7398. – P. 376-380.

17. Control of cell identity genes occurs in insulated neighborhoods in mammalian chromosomes / J.M. Dowen [et al.] // Cell. – 2014. – Vol. 159. – № 2. – P. 374-387.

18. iEnhancer-GAN: A Deep Learning Framework in Combination with Word Embedding and Sequence Generative Adversarial Net to Identify Enhancers and Their Strength / R. Yang [et al.] // International Journal of Molecular Sciences. – 2021. – Vol. 22. – iEnhancer-GAN. – № 7. – P. 3589.

19. Yu M. The Three-Dimensional Organization of Mammalian Genomes / M. Yu, B. Ren // Annual review of cell and developmental biology. – 2017. – Vol. 33. – P. 265-289.

20. Nanni L. Spatial patterns of CTCF sites define the anatomy of TADs and their boundaries / L. Nanni, S. Ceri, C. Logie // Genome Biology. – 2020. – Vol. 21. – № 1. – P. 197.

21. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions / D.G. Lupiáñez [et al.] // Cell. – 2015. – Vol. 161. – № 5. – P. 1012-1025.

22. Lupiáñez D.G. Breaking TADs: How Alterations of Chromatin Domains Result in Disease / D.G. Lupiáñez, M. Spielmann, S. Mundlos // Trends in genetics: TIG. – 2016. – Vol. 32. – Breaking TADs. – № 4. – P. 225-237.

23. 3D genome alterations and editing in pathology / E.A. Tiukacheva [et al.] // Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. – 2023. – Vol. 31. – № 4. – P. 924-933.

24. Multiplex CRISPR/Cas9 genome editing in hematopoietic stem cells for fetal hemoglobin reinduction generates chromosomal translocations / C. Samuelson [et al.] // Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. – 2021. – Vol. 23. – P. 507-523.
Список литературы
Лекция чл.-корр. РАН, проф. Сергея Владимировича Разина «3D-геномика» в рамках лектория «Настоящая биология» https://pcr.news/video/3d-genomika-lektoriy-nastoyashchaya-biologiya/
Полезные материалы
ПОДЕЛИТЕСЬ В СОЦСЕТЯХ!
Мессенджеры
Отправляйте нам! Узнайте подробнее в мессенджерах или напишите нам на сайте
Задать вопрос на сайте

У ВАС ЕСТЬ МАТЕРИАЛЫ, КОТОРЫМИ ВЫ ХОТЕЛИ БЫ ПОДЕЛИТЬСЯ?

Made on
Tilda