органеллы

Клетку можно представить как фабрику, в которой происходит множество биохимических процессов, составляющих метаболизм. Все эти реакции катализируются специальными белками — ферментами. Эта фабрика подразделена на отдельные ≪цеха≫ — органеллы или компартменты, в которых происходят отдельные ветви метаболизма. В школьной программе основное внимание уделяется мембранным органеллам, таким как митохондрии, аппарат Гольджи, хлоропласты и другие. В их случае уникальность внутренней среды достигается благодаря мембране, отделяющей ее от окружающей цитоплазмы. И ещё недавно считалось, что по такому плану устроено большинство клеточных органелл, но сейчас мы знаем, что это не так.

Открытием последних 15 лет стало обнаружение большого разнообразия органелл, которые не имеют какой-либо физической границы. Их называют биоконденсатами. Если мембранные органеллы можно сравнить с мыльными пузырями, имеющими жидкую границу и полыми внутри, то немембранные — с каплями масла в воде. Они возникают благодаря притяжению между молекулами, входящими в их состав. Когда в небольшой области пространства концентрируется большое количество белков, ответственных за общий молекулярный процесс, то в этой области они образуют жидкую каплю. В науке это называют LLPS — liquid-liquid phase separation. Процесс похож на то, как насыщенный водяной пар конденсируется на холодной поверхности.

Жидкая природа этих органелл заключается, во-первых, в динамичности входящих в состав конденсата молекул — они находятся в постоянном движении, могут его покидать или вновь в нем оказываться. Это можно наблюдать в микроскоп с помощью метода FRAP — fluorescent recovery after photobleaching. Суть в том, что один из белков конденсата помечают флуоресцентной меткой, а затем точечно мощным лазером на небольшом участке высвечивают. Поскольку молекулы внутри конденсатов подвижны, возникшая нефлуоресцирующая пустота быстро заполняется. Это позволяет отличать капли от твердых белковых телец — в последних высвеченный участок остается темным. Другим критерием «жидкости» являются сферическая форма — результат сил поверхностного натяжения (твердые тельца чаще неправильной формы), и, наконец, способность к слиянию при контакте и растворение под действием высоких концентраций солей или спирта 1,6-гександиола.

В нормальной физиологии клетки конденсаты участвуют в очень широком спектре процессов: от регуляции генетических программ до клеточного пищеварения или передвижения. Однако биоконденсаты — палка о двух концах, ведь они являются и ключевыми участниками большого числа патологий, что ставит вопрос о возможности влиять на их свойства химическими веществами — лекарствами.

Вирусные белки и нуклеиновые кислоты концентрируются в специализированных компартментах, которые служат для репликации, увеличения числа вирусных частиц. Природа таких компартментов может быть разной и включать в себя как мембранные структуры, так и жидкие капли. Последние образует, например, респираторно-синцитиальный вирус (РСВ), который поражает верхние дыхательные пути и обнаруживается повсеместно. Так, в США почти все дети переболевают этой инфекцией к возрасту двух-трех лет с возможностью повторных инфекций. У пациентов до 6 месяцев с ослабленным иммунитетом или сопутствующими тяжелыми заболеваниями может развиться тяжелая форма инфекции, приводящая к сильному воспалению дыхательных путей. В цитоплазме инфицированных клеток вирусные белки и РНК, содержащая его генетический материал, формируют биоконденсаты.

В 2021 году в журнале Nature вышла статья [2], посвященная разработке препарата против РСВ. В ней авторы показали, что два низкомолекулярных вещества (А3Е и СРМ), способствуют загустению вирусных конденсатов, в результате чего тормозится репликация вируса. Для проверки действия препаратов они исследовали физические свойства репликационных компартментов до и после обработки потенциальными лекарствами. Вот, что удалось выяснить:

Этап 1. Эффект веществ на клеточных культурах. К одному из белков в составе вирусных конденсатов исследователи пришили флуоресцентную метку, что позволило провести детальную микроскопию. Благодаря тому, что LLPS РСВ происходит из-за взаимодействия между заряженными аминокислотами, конденсаты чувствительны к высоким концентрациям солей, так как их ионы препятствуют белок-белковому взаимодействию.

Что дал этап? До обработки лекарствами конденсаты демонстрировали свойства жидких капель — имели сферическую форму, сливались при контакте, исчезали при высоких концентрациях солей и быстро восстанавливали флуоресценцию после частичного обесцвечивания лазером (метод FRAP). После обработки обоими веществами конденсаты потеряли способность сливаться, частично утратили сферичность, стали нечувствительны к солям и время восстановления флуоресценции сильно увеличилось.

Картинка из [2]. А3Е и СРМ ведут к затвердеванию LLPS-конденсатов РСВ. а – репликационные компартменты РСВ представляют собой жидкие капли, сливающиеся при контакте b – в контроле (mock, переведу) после частичного высвечивания репликационные компартменты РСВ восстанавливают флуоресценцию, что говорит о наличии постоянного перемешивания и внутренней диффузии; при добавлении А3Е или СРМ высвеченный участок остается темным. c – в контроле (mock) динамичные конденсаты РСВ растворяются воздействием высоких концентраций солей (гипотонический шок) и восстанавливаются при нормализации уровня соли; при воздействии А3Е и СРМ конденсаты перестают реагировать на изменения солености

Этап 2. Проверка действия лекарств на мышах, зараженных вирусом. Грызунам давали различные дозировки А3Е и СРМ ежедневно, начиная со дня инфицирования.

Что дал этап? На четвертый день очаг заражения в легких почти полностью исчез, что подтвердило, что воздействием на конденсаты можно тормозить размножение вируса в живом организме, то есть in vivo.

Картинка из [2] Влияние А3Е и СРМ на развитие РСВ-инфекции у мышей. Слева – контрольная группа, по центру и справа – мыши, которым давали А3Е и СРМ соответственно в дозах 15 мг/кг

Вирус, попадая в клетку, заставляет ее синтезировать новые вирусные частицы, что способствует его размножению и распространению. Поэтому в противовирусной защите важнейшую роль играет интерферон — небольшой белок, подавляющий общий синтез белка в инфицированных клетках. Производимый зараженной клеткой интерферон не позволяет вирусам размножаться, хотя при таком раскладе инфицированные клетки жертвуют собой на благо всего организма. Однако интерферон синтезируется только в ответ на инфекции, так как для здоровых клеток он губителен. За распознавание вируса отвечают внутриклеточные рецепторы врожденного иммунитета, которые при этом передают сигнал на другие белки, что в конечном итоге приводит к включению гена интерферона. Эта последовательность реакций получила название интерфероновый сигналинг и лежит в основе врожденного иммунитета.

Биоконденсаты используются вирусами не только для репликации, но и для подавления клеточного иммунитета. Так, например, происходит у небезызвестного SARS-CoV-2. Когда открыли [3], что он тоже формирует биоконденсаты, стали искать, какие белки отвечают за это. Образующий его оболочку нуклеокапсидный белок содержит три IDRs, РНК-связывающий домен и домен для димеризации, поэтому подозрение пало на него. В 2023 году вышла статья [4] в журнале Nature Cell Biology, где было показано, что образование капель нуклеокапсидного белка SARS-CoV-2 помогает этому вирусу противостоять врожденному иммунитету. Авторы продемонстрировали, что фазовые конденсаты SARS-CoV-2 препятствуют работе одного из активаторов синтеза интерферона — белка MAVS.

Для подтверждения способности нуклеокапсидного белка образовывать биоконденсаты исследователи пометили белок флуоресцентной меткой. Очищенный и флуоресцентно меченый белок образовывал сферические тельца, которые были чувствительны к содержанию солей и быстро восстанавливали флуоресценцию после высвечивания, что говорило об их жидкой природе. Такие же тельца наблюдались и в цитоплазме клеток, где они концентрировали вирусную РНК. Для подбора веществ, которые препятствовали бы образованию конденсатов, необходимо было установить, какая именно часть белка обуславливает формирование капель. Удаляя разные участки в нуклеокапсидном белке, ученые пришли к выводу, что LLPS компартменты перестают формироваться после удаления домена димеризации. По интересному совпадению, удаление именно этого домена вернуло клеткам, зараженным SARS-CoV-2, способность синтезировать интерферон. Это натолкнуло на мысль, что биоконденсаты нужны вирусу для подавления иммунитета.

Дальнейшая работа показала, что только способный к LLPS нуклеокапсидный белок (без удаления домена димеризации) обрывал сигнал от рецепторов врожденного иммунитета, не давая запускаться синтезу интерферона. Оставался вопрос, на каком этапе этот сигнал прерывался. Исследователи выяснили, что в клетках нуклеокапсидный белок физически контактирует с белком MAVS, важным для синтеза интерферона. При активации MAVS формирует на мембране митохондрий молекулярные кластеры, которые представляют собой большие платформы, с которыми могут стыковаться другие участники каскада и тоже активироваться. Вирусный же белок, с одной стороны, не дает MAVS формировать кластеры и препятствует взаимодействию с непосредственными активаторами синтеза интерферона. Поскольку нуклеокапсидный белок, мутантный по домену димеризации, никакого влияния на работу MAVS не оказывал, авторы предположили, что аналогичных эффектов можно добиться, ингибируя LLPS нуклеокапсидного белка.

Картинка из [3] – механизм подавления действия белка MAVS конденсатами SARS-CoV-2

Чтобы помешать образованию конденсатов НБ и проверить, как это скажется на противовирусном иммунитете, авторы использовали анти-пептиды. Эти пептиды конкурентно взаимодействуют с доменом димеризации и не дают НБ формировать межмолекулярные связи. В мышах, которым давали терапевтический пептид, был сильно выше уровень интерферона и ниже содержание вирусной РНК в различных органах и тканях. Легкие мышей контрольной группы были сильно воспалены после инфицирования, а на легкие мышей из опытной группы вирус оказал лишь минимальный эффект.

Так, последние работы демонстрируют две противоположные, но эффективные стратегии борьбы с вирусными конденсатами — их затвердевание или растворение.

Биоконденсаты со временем могут менять свою консистенцию самопроизвольно, начиная больше напоминать гели или стекла. Такой феномен получил название «старение» или «матурация» конденсатов. Некоторые серьезные нейропатологии, такие как боковой амиотрофический склероз, который был у Стивена Хокинга,а также болезнь Альцгеймера, хорея Гентингтона или паркинсонизм возникают из-за образования твердых белковых телец в нейронах. Белки, входящие в эти тельца, в норме способны формировать биоконденсаты. В нейронах такие биоконденсаты могут, например, связывать молекулы РНК и регулировать образование белка (как в случае белка FUS). Со временем из-за «старения» молекулы внутри таких биоконденсатов становятся неподвижны, и все процессы в них прекращаются. Частой причиной загустения конденсатов оказываются мутации в генах этих белков, изменяющие аминокислотную последовательность в тех участках, которыми они между собой взаимодействуют. В результате белок-белковое взаимодействие становится слишком сильным, что приводит к постепенному затвердеванию конденсатов и различным патологиям.

Болезнь Альцгеймера. Терапия нейропатологий, направленная на разрушение или предотвращение образования белковых телец, делает первые шаги. Например, активно идет подбор лекарств против возникновения твердых агрегатов белка TAU. Появление в нейронах нерастворимых фибрилл этого белка — причина возникновения болезни Альцгеймера. В здоровых нейронах TAU играет важную роль в организации цитоскелета — белкового «каркаса» клеток. При возникновении мутаций или нарушении некоторых молекулярных процессов TAU теряет связь со структурами цитоскелета и накапливается в цитоплазме, где он может формировать биоконденсаты. Они активно связывают РНК, поскольку любая РНК заряжена отрицательно, а TAU белок — положительно. Со временем такие конденсаты затвердевают и служат затравкой для возникновения фибрилл.

Недавняя работа в Nature Scientific Reports говорит [5] о создании потенциального лекарства — сурамина — направленного на предотвращение связывания Tau белком РНК. Молекулы этого лекарства также имеют отрицательный заряд, поэтому успешно конкурируют с РНК за связывание с Tau. Сурамин взаимодействует с Tau слабее, чем РНК, поэтому конденсаты с ним сохраняют жидкую консистенцию и не вызывают образование фибрилл.

Боковой амиотрофический склероз — нейродегенеративное заболевание, вызванное гибелью моторных нейронов в спинном мозге, в результате чего до мышц перестают доходить сигналы от нервной системы. Эта болезнь вызвана накоплением нерастворимых агрегатов РНК-связывающего белка FUS. Этот РНК-связывающий белок в норме выполняет в клетке огромное количество важных функций и формирует биоконденсаты. Мутации в гене этого этого белка приводят к его скоплению в твердые, а не жидкие, образования. Способом борьбы с патологическими биоконденсатами является тотальное снижение уровня белка Fus в мотонейронах.

В недавней работе в Nature Medicine [6] авторы создали терапевтическое вещество ION363, связывающееся с РНК белка FUS и приводящее к ее деградации, что не дает этому белку синтезироваться. В результате количество этого белка снижается на 50-80%. У мышей, которым сразу после рождения ввели ION363, первые 4 месяца не наблюдалось никаких аномалий развития мотонейронов. В то же время в контрольной группе без этого препарата количество мотонейронов за это время сократилось в среднем на 10-15%. После шести месяцев, когда препарат стал распадаться и больше не обнаруживался в организме мышей, и у экспериментальной группы появились выраженные признаки дегенерации нервных клеток.

Так, похоже, что снижение белка FUS не сильно препятствует выполнению им нормальных функций, однако мешает образованию патологических агрегатов. Во всех вышеупомянутых случаях болезни вызывались биоконденсатами на основе естественных вирусных или относительно слабо мутировавших белков человека, закодированных в его геноме и в норме присутствующих в клетках. Но что будет, если в организме будут такие сильные перестройки в хромосомах, что это приведет к возникновению не существующих в норме белков?

Еще одной обширной группой болезней, в проявлении которых начинает проясняться роль биоконденсатов, являются онкопатологии. Рак вызван сбоем в генетических программах клетки, из-за которого она перестает «осознавать» свою тканевую принадлежность, то есть трансформируется. Такие клетки начинают бесконтрольно делиться и формировать опухоли, в то время как у нормальных клеток число делений строго отрегулировано.

ДНК можно представить как огромную библиотеку, содержащую всю информацию об организме. В каждом типе клеток из этой библиотеки прочитывается строго определенный набор книг — отдельных генов. Какие гены будут прочитываться, а какие нет, в каждом типе клеток регулирует свой набор регуляторных белков — транскрипционных факторов (ТФ).

В нашем геноме помимо самих генов существует очень богатый репертуар последовательностей, регулирующих их экспрессию. Эти последовательности узнаются активаторами или репрессорами транскрипции. Если несколько последовательностей ДНК, связывающих активаторы, оказываются сближены на участке ДНК, то такой участок называется энхансером. Такие последовательности включают в себя энхансеры и сайленсеры. Энхансеры представляют собой множественные сайты связывания ТФ. Концентрируясь локально, эти белки формируют биоконденсаты. Они играют значительную роль в регуляции экспрессии генов, поддерживая высокую концентрацию транскрипционных факторов вблизи активных генов.

Онкологические заболевания возникают из-за гиперактивации в норме молчащих генов — онкогенов, высокий уровень экспрессии которых приводит к бесконтрольному клеточному делению и образованию опухолей. К патологической, аберрантной, активации часто приводит образование транскрипционных конденсатов на основе мутантных ТФ. Эти ТФ возникают из-за ошибок в репарации двунитевых разрывов в ДНК, вызванных различными повреждающими факторами. Такие разрывы ежедневно возникают десятками в каждой клетке человека, но из-за ошибок репарации могут неправильно сшиваться. В результате возникают химерные гены, состоящие из фрагментов генов двух белков. В этом случае домен, ответственный за фазовую сепарацию экспрессируемого в норме в этих условиях белка может оказаться объединен с ДНК-связывающим доменом мало или не экспрессируемого ТФ. Химерные белки благодаря лишь частичной неструктурированности выглядят для клетки как нормальные ТФ, а потому не деградируются клеточными системами контроля. Это приводит к возникновению транскрипционных конденсатов там, где их в норме быть не должно, что вызывает нарушения в активации генов и в пространственной структуре генома. Эти конденсаты лежат в основе таких онкопатологий, как острая миелоидная лейкемия, или ОМЛ, и саркома Юинга.

При саркоме Юинга в результате транслокации происходит слияние неструктурированного домена белка EWS и ДНК-связывающего домена белка FLI1. Возникающие в результате транскрипционные конденсаты приводят к масштабным изменениям в пространственной структуре генома, в том числе перераспределению энхансер-промоторных контактов.

В ОМЛ в состав химерных ТФ входит белок нуклеопорин 98, или NUP98. В норме этот белок не обнаруживается в нуклеоплазме и входит в состав ядерных поровых комплексов, регулирующих ядерные импорт и экспорт. Примерно треть такого белка состоит из неструктурированных областей, перемежающихся РНК-связывающими участками. Это создает идеальные условия для фазовой сепарации, которая в норме происходит в ядерных порах. Возникающие благодаря таким белкам транскрипционные конденсаты вызывают образование энхансер-промоторных петель, стимулирующих экспрессию онкогенов и возникновение лейкемии.

В недавней работе, опубликованной в Nature Chemical Biology, авторам удалось [7] идентифицировать вещество LY2835219, способствующее растворению онкоконденсатов. Это вещество способствует поглощает химерные ТФ лизосомами — мембранными органеллами, в которых происходит клеточное пищеварение. Кислая среда и обилие гидролитический ферментов в них приводят к полному распаду патогенных белков на аминокислоты, которые могут использоваться клеткой для построения нормальных белков.

Несмотря на обнаружение все большего числа патогенных биоконденсатов, поиск лекарств против них по-прежнему требует перебора большого количества уже известных химикатов чтобы в какой-то момент найти у одного или нескольких из них “противоконденсатную” активность – это называется скрининг. В будущем было бы здорово сразу подбирать формулу лекарства, исходя из биохимического состава конденсатов. Вероятно, это будет возможно делать, сочетая экспериментальные данные с технологиями искусственного интеллекта.

Если рассматривать конденсаты как терапевтическую мишень, одной из центральных задач становится подбор небольших молекул, потенциальных лекарств, воздействующий на конкретный тип конденсатов, то есть обладающих селективностью. Для исследования жидкофазных конденсатов in vitro или на клеточных культурах активно применяется алифатический спирт 1,6-гександиол. Нарушая гидрофобные взаимодействия, этот химикат растворяет многие биоконденсаты, поэтому его используют для доказательства жидкофазной природы органелл.

Существенный недостаток этого вещества состоит в отсутствии селективности и наличии большого списка побочных эффектов: от ингибирования ферментов до нарушения архитектуры генома и индукции клеточной гибели. Степень этих эффектов может варьировать в зависимости от тканевой принадлежности. По этим причинам 1,6-гександиол невозможно применять в медицине. Также стоит упомянуть, что не все биоконденсаты стабилизируются гидрофобными взаимодействиями, благодаря чему их чувствительность к 1,6-гександиолу сильно варьируется.

Несмотря на нетривиальность задачи получения селективно действующих на конденсаты лекарств, в этом направлении активно делаются шаги. Например, в недавней работе ученые показали [8], что различные противоопухолевые препараты, такие как цисплатин, митоксантрон, JQ1, селективно концентрируются в транскрипционных конденсатах. Ни один из этих препаратов не проникает в конденсаты неактивного хроматина или в другие жидкие ядерные компартменты, однако они концентрируются с повсеместными транскрипционными коактиваторами – белками Медиатором и BRD4. Иногда они также накапливаются в ядрышке, где происходит образование белок-синтезирующих молекулярных машин – рибосом. Это достигается за счет специфического взаимодействия с аминокислотами в этих белках, поскольку аминокислотные замены существенно сказались на степени концентрирования веществ в конденсатах. Однако это исследование не дает ответа на вопрос, как подобрать вещества, специфичные к интересующим компартментам.

Источник - [14] Селективное распределение препаратов THZ1, JQ1, FLTX1 и митоксантрона в конденсаты ключевых транскрипционных белков MED1 и BRD4. В случае митоксантрона еще и в конденсаты ядрышковых белков FIB1 и NPM1. В ядрышке тоже идет активная транскрипция

В целом, многие используемые на сегодняшний день лекарства или пищевые добавки неравномерно распределяются в живых клетках, концентрируясь, в том числе, в немембранных компартментах. Эти вещества, в силу своей молекулярной структуры, обладают способностью к флуоресценции, что позволяет анализировать их распределение в клетках с помощью микроскопии.

Картинка из [15] Неравномерное распределение различных химикатов в клетках. Оно обусловлено, отчасти, сродством к конкретным белкам, отчасти – к химическому микроокружению

Интересно, что такое концентрирование не всегда происходит в местах сосредоточения белка, с которым эти вещества должны взаимодействовать, что указывает на важность химического микроокружения наряду со специфическим взаимодействием с конкретным белком. Существуют алгоритмы на основе машинного обучения, позволяющие подбирать вещества, селективно концентрирующиеся в различных типах конденсатов. Эта селективность достигается отчасти за счет структурного взаимодействия лекарств с белками, а отчасти за счет общего сродства к химической среде, которую внутри себя создают биоконденсаты. Искусственный интеллект анализирует общие химические черты молекул, для которых экспериментально показано концентрирование в определенном типе конденсатов, выделяет общие черты строения и на основании этого предсказывает химические черты, определяющие селективность.

Источник - [15] Из большой библиотеки одобренных FDA веществ искусственный интеллект предсказывает наличие или отсутствие их селективного накопления в интересующем конденсате. Предсказания ИИ могут быть проверены in vivo с помощью флуоресцентной микроскопии. На изображении f - конфокальная микрофотография митоксантрона, концентрирующегося в ядрышке. g – конфокальная микрофотография распределения триптантрина, концентрирующегося в участках транскрипционно-неактивного гетерохроматина – хромоцентрах

В свежей статье [9] из Nature Chemical Biology анализировались транскрипционные конденсаты, ядрышко и конденсаты неактивного хроматина. Проанализировав зависимость между структурой молекулы и типом конденсата, селективно ее накапливающего, авторам удалось обучить искусственный интеллект подбирать молекулы, имеющие к разным типам конденсатов селективное сродство. Развитие технологий на основе ИИ имеет все шансы существенно упростить подбор лекарственных препаратов в будущем.

Мы живем во время активного изучения нового уровня организации субклеточных структур — немембранных органелл. Они выполняют множество полезных функций в клетках, однако и участвуют в развитии многих патологических процессов, что делает их перспективной терапевтической мишенью. Сейчас идет активный подбор низкомолекулярных органических соединений, которые могли бы селективно распределяться в такие конденсаты. Известные органические молекулы могут вызывать образование, растворять или менять консистенцию жидкофазных конденсатов. Некоторые такие вещества, подобранные в экспериментах in vitro и на живых клетках, оказывают терапевтическое действие и на живые организмы (in vivo), так что не за горами применение знаний о жидких органеллах на практике и улучшение качества жизни людей.

Источник - [14] Селективное распределение препаратов THZ1, JQ1, FLTX1 и митоксантрона в конденсаты ключевых транскрипционных белков MED1 и BRD4. В случае митоксантрона еще и в конденсаты ядрышковых белков FIB1 и NPM1. В ядрышке тоже идет активная транскрипция