клубеньки

Горох, как и любое другое растение, не может жить без азота. Чтобы его получить, бобовые выстроили стратегию взаимодействия с почвенными бактериями — ризобиями. В результате такого сотрудничества растение образует на корнях новые органы, клубеньки, в которых происходит фиксация молекулярного азота и включение его в состав органических соединений [1].

Чтобы раскрыть все аспекты функционирования бобово-ризобиального симбиоза у гороха и научиться им управлять, нам тоже нужно выстроить стратегию.

Разбираемся с азотом.
Азотные удобрения являются дорогими и важными факторами плодородия почв, однако при высокой их концентрации у гороха «отключается» система образования клубеньков. Это происходит потому, что растению не нужно тратить энергию на симбиоз с ризобиями, если у него есть «легкий» источник питания.

Клубеньки — это «фабрика» азота: если мы научимся управлять количеством и размером клубеньков, то «фабрика» будет работать с большей производительностью, даже если в почве уже есть некоторое количество азота. Эта «способность» сделает горох более устойчивым к изменениям условий в окружающей среде, при этом сохранив почвенное плодородие. Но как мы можем создать генетические линии, способные к высокопродуктивному накоплению белка в любых агроэкологических условиях? Для начала необходимо выяснить, какие гены участвуют в этом процессе.

Рисунок 1. Путь к устойчивому сельскому хозяйству (изображение создано с использованием инструмента для научной визуализации BioRender.com.)

Ключевыми участниками в реакции гороха на присутствие азота в почве являются пептиды CLE — CLAVATA3/Embryo Surrounding Region. Ранее ученые обнаружили четыре гена PsCLE, которые предварительно играют роль в симбиозе. При этом три из них, PsCLE12, PsCLE13 и PsNIC, показали высокий уровень экспрессии в ответ на обработку нитратами [2]. Это значит, что они ответственны за запуск механизмов реакции растения на азот, что может помочь найти «рычаги» управления симбиозом.

Но как ризобии попадают внутрь корня? Все дело в специфических «сигналах», которые они отправляют в корни гороха в ответ на выделяемые в почву флавоноиды. Эти сигналы — Nod-факторы, липохитоолигосахариды (Lipochitin oligosaccharides - LCO), синтезируются и выделяются бактериями рода Rhizobium, Bradyrhizobium и Azorhizobium [3]. Nod-факторы распознаются особыми рецепторами на поверхности корневых клеток бобовых растений. Связывание Nod-факторов с рецепторами запускает сигнальный путь, который приводит к перепрограммированию клеток корня и индукции образования клубеньков (Zuanazzi et al., 1998; Chovanec et al., 2005).

Что же такое пептидные гормоны?
При развитии симбиотических клубеньков также происходит активация генов CLE, но, чтобы продукты этих генов проявляли свою функциональность, необходимы различные модификации последовательности белка CLE [4], [5] (Рисунок 2). На первом этапе добавляется особый элемент — гидроксипролин, а в последствии навешиваются 3 остатка сахара (арабинозы).

Рисунок 2. Процессинг пептидов CLE (по Betsuyaku, 2011)

Когда в дело вступает функциональная геномика.
Но что же происходит за кулисами этого молекулярного спектакля? Чтобы узнать это, мы заглянули в самое сердце клеток — их ДНК.

Благодаря методам обратной генетики мы можем изучать функцию того или иного гена и его влияние на фенотип. Чтобы понять, какие молекулярные пути затрагивает механизм регулирования количества клубеньков, создали растения с трансгенными корнями, проявляющими высокую активность четырех известных генов PsCLE.

На сегодняшний день одним из популярных методов генетики является транскриптомный анализ. Он позволяет выявить гены, которые изменили свою активность в экспериментальной группе (в данном случае, при высокой экспрессии генов PsCLE) по сравнению с контрольной группой (Рисунок 3). Оказалось, что сверхэкспрессия PsCLE12 и PsCLE13 запускает целый каскад изменений: одни гены активируются, словно включаясь в работу «азотной фабрики», другие, наоборот, затихают, возможно, предотвращая избыточное образование клубеньков.

Рисунок 3. Количество дифференциально-экспрессируемых генов: a) количество транскриптов, соответствующих 11 генам, было увеличено в трансгенных корнях с конструкциями для сверхэкспрессии генов PsCLE12 и PsCLE13; б) количество транскриптов, соответствующих 16 генам было снижено в трансгенных корнях с конструкциями для сверхэкспрессии генов PsCLE12 и PsCLE13.

Среди генов, увеличивающих свою экспрессию, обнаружили фактор TML (TOO MUCH LOVE), а с помощью метода ПЦР в реальном времени подтвердилась связь пептидов c работой данных генов.

Продукты генов TML являются компонентами комплекса белков, который участвует в нанесении на другие белки особых “меток” (убиквитина), что впоследствии приводит к деградации. Предполагается, что TML связан с разрушением положительных регуляторов симбиоза, однако, конкретные их мишени еще не выявлены (Mika Hayashi-Tsugane et al., 2022)

Значит, работа пептидов CLE может быть системной, то есть на уровне всего растения. Вероятно, достаточно будет изменить работу генов в корне, чтобы получить совершенно новый фенотип клубеньков у гороха. Но какой сигнальный путь работы наших пептидов ключевой для активации или подавления развития симбиотических клубеньков?

К сожалению, точно это еще неизвестно, но совсем недавно обнаружили, что, возможно, пептиды CLE влияют на самый первый этап узнавания растения и бактерии. Оказалось, что активность работы гена PsSYM37, рецептора к Nod-фактору, сигналу, выделяемому ризобиями для установления симбиоза, снижается в трансгенных корнях гороха с высокой экспрессией генов CLE (Рисунок 4).

Рисунок 4. Результаты анализа экспрессии генов PsTML при сверхэкспрессии генов PsCLE методом ПЦР в реальном времени. Гистограммы показывают количество транскриптов (РНК) генов PsTML.

Так, шаг за шагом мы приближаемся к разгадке тайны управления клубеньками, открывая путь к созданию сельскохозяйственных культур, способных самостоятельно обеспечивать себя азотом и давать высокие урожаи даже в неблагоприятных условиях. Это может стать настоящим прорывом в борьбе с голодом и сохранении плодородия почв. Исследования в этой области могут спасти миллионы людей по всему миру.